背景介紹

近年來，反應(yīng)數(shù)據(jù)采集、處理和控制的新興技術(shù)已開始將制藥過程開發(fā)轉(zhuǎn)變?yōu)閿?shù)據(jù)日益豐富的科學領(lǐng)域。制藥商已開始采用“工業(yè) 4.0”的精神，其中模擬、系統(tǒng)集成和大型數(shù)據(jù)集的生成是更加關(guān)注質(zhì)量、安全、成本效益和可持續(xù)性的關(guān)鍵推動因素。充分利用這些技術(shù)進步有望在開發(fā)和執(zhí)行化學工藝的速度和可靠性方面取得顯著改善。制藥監(jiān)管機構(gòu)最近發(fā)起的質(zhì)量源于設(shè)計 (QbD) 計劃鼓勵制造商基于對反應(yīng)的透徹理解來設(shè)計和控制流程。這一舉措的關(guān)鍵是通過過程分析技術(shù) (PAT) 實時采集化學過程開發(fā)和過程中監(jiān)控的數(shù)據(jù)。

當前，制藥行業(yè)的范式正在從傳統(tǒng)的批量生產(chǎn)轉(zhuǎn)向用于制備活性藥物成分 (API) 的連續(xù)加工，這得到了 PAT 可用性和實施的增加的支持。最近的審查強調(diào)了 PAT 在連續(xù)流環(huán)境中的成功實施。PAT 已在連續(xù)流系統(tǒng)中用于實現(xiàn)過程控制的反饋回路，黑盒優(yōu)化，如實驗設(shè)計 (DoE) 和自動自我優(yōu)化，動力學模型鑒別和參數(shù)估計，并指導(dǎo)藥物發(fā)現(xiàn)程序.最常用的實時在線 PAT 工具是 UV/Vis、Raman、IR、和NMR。最近，它們的使用變得越來越流行，部分原因是臺式設(shè)備和流通池的商業(yè)可用性增加。此外，還描述了在連續(xù)流動平臺內(nèi)使用集成色譜分析技術(shù)，例如高效/超高效液相色譜 (HPLC/UPLC) 和 GC。然而，在這些情況下，通常需要在進樣前進行額外的樣品制備。在學術(shù)和工業(yè)實驗室中，離線執(zhí)行所有這些分析技術(shù)仍然很常見。在這些情況下，樣品制備會浪費時間，并且分析的樣品并不總是代表反應(yīng)性能。與僅使用離線分析的情況相比，利用實時分析的流程將導(dǎo)致更快且通常更可靠的流程優(yōu)化。

上述示例表明，在連續(xù)流系統(tǒng)中集成單個分析儀器以分析單步反應(yīng)現(xiàn)在在連續(xù)處理社區(qū)中已經(jīng)很好地建立起來。然而，流動化學的一個關(guān)鍵優(yōu)勢是能夠在集成的連續(xù)流動系統(tǒng)中執(zhí)行復(fù)雜的多步驟轉(zhuǎn)換，而無需人工干預(yù)。目前，在不中斷的情況下將不同的反應(yīng)器模塊和分析組合成一個完全集成的連續(xù)過程的先例有限。連續(xù)流技術(shù)通常不靈活，不同步驟之間會出現(xiàn)兼容性問題。使用不同技術(shù)在連續(xù)流系統(tǒng)內(nèi)的多個點進行反應(yīng)分析對于快速參數(shù)優(yōu)化和有效控制過程性能以完全實現(xiàn)多步轉(zhuǎn)換至關(guān)重要。現(xiàn)有的多步連續(xù)流轉(zhuǎn)換研究通常在分離的連續(xù)流步驟中使用不同的 PAT 儀器。

精心設(shè)計的連續(xù)流反應(yīng)器已被證明可以顯著提高各種系統(tǒng)的反應(yīng)性能；特別是那些對混合敏感、高度放熱或涉及短期中間體的產(chǎn)品。因此，由多個離散單元組成的模塊化反應(yīng)器系統(tǒng)最適合這些應(yīng)用，因為每個“模塊”都可以優(yōu)化以適應(yīng)所需的化學反應(yīng)并重新配置以適應(yīng)無數(shù)不同的反應(yīng)系統(tǒng)。

由于其增強的傳熱和傳質(zhì)特性，在微反應(yīng)器系統(tǒng)中使用有機金屬試劑進行的反應(yīng)可以觀察到顯著改進，但有機金屬試劑可能會由于反應(yīng)器通道內(nèi)的水分敏感性和固體形成而帶來重大的處理挑戰(zhàn)。在間歇式反應(yīng)器中，這種類型的反應(yīng)通常在低溫下進行，但流動處理可以承受更高的溫度。我們目前的研究興趣使我們研究了多個 PAT 儀器（IR、NMR 和 UPLC）在模塊化流動反應(yīng)器系統(tǒng)中的集成，以監(jiān)測具有挑戰(zhàn)性的多步有機金屬轉(zhuǎn)化。

2019年4月08日，歐洲著名連續(xù)流專家C. Oliver Kappe教授研究小組的一項成果發(fā)表在Reaction Chemistry & Engineering期刊上（DOI: 10.1039 / C9RE00087A ）。該文章（Laboratory of the future: a modular flow platform with multiple integrated PAT tools for multistep reactions）以在線分析與連續(xù)流化學相結(jié)合，構(gòu)建了有利于工業(yè)4.0的未來實驗室如圖1b所示，并以化合物丙酸叔丁酯在該體系下合成β-羥基丁酸酯類產(chǎn)物為例進行了說明。如圖1a所示。

圖1.  a）反應(yīng)方案顯示丙酸叔丁酯1的去質(zhì)子化，其與醛親電子試劑3的反應(yīng)，然后驟冷，得到醛醇產(chǎn)物5；b）本研究中使用的zui終反應(yīng)裝置示意圖，顯示泵，傳感器（T =溫度傳感器; P =壓力傳感器）和PAT儀器的位置，以及它們與LabVision控制系統(tǒng)的連接（黑色虛線=電信號連接線，藍色虛線=循環(huán)換熱介質(zhì)路線）。

結(jié)果與討論：

第一步是通過用二異丙基氨基鋰（LDA）去質(zhì)子化丙酸叔丁酯1來生成烯醇化物2（圖1a）。然后烯醇化物2與4-氟苯j(luò)ia醛3反應(yīng)生成金屬化的中間體4. 隨后用水原位淬滅得到所需產(chǎn)物5. 這類化學物質(zhì)廣泛用于靶向合成相關(guān)藥物。

整個系統(tǒng)包括連續(xù)流反應(yīng)器，四個進料泵，進料溶液包括：

1. 0.4M底物1和內(nèi)標（聯(lián)苯）在THF中的溶液

2. 0.44M LDA在THF中的溶液

3. 0.48M 4-氟苯甲醛3在THF中的溶液，

4. 水

首先將基質(zhì)1和LDA溶液混合以在1#反應(yīng)片中形成烯醇化物2，停留時間為約5秒。隨后，將醛3溶液引入2#反應(yīng)片中，在驟冷之前再反應(yīng)80秒。驟冷的停留時間相當于約18秒。

將來自1#反應(yīng)模塊的流出物通過IR流通池進行在線IR分析。然后使反應(yīng)混合物通過在線流動池（0.8mL內(nèi)部體積），用臺式NMR光譜儀（Spinsolve Ultra 43MHz，Magritek）監(jiān)測。然后引入水以淬滅反應(yīng)混合物并收集出口混合物。在引入水之后在線進行UPLC分析并通過對分餾的反應(yīng)器輸出進行取樣來離線。在在線分析的情況下，將工藝流出的樣品轉(zhuǎn)移，然后用H2O / MeCN稀釋。

隨后，將6號通閥（2.6μL注射體積）注入等分試樣的稀釋流到LC柱上。連續(xù)流量設(shè)置中的泵和傳感器連接到HiTec Zang LabManager單元，并由LabVision軟件控制。

結(jié)果得到圖2，IR分析圖，圖3，NMR，圖4，UPLC分析圖，可以在反應(yīng)的不同階段通過儀器實時監(jiān)測反應(yīng)及時觀察到過程的化學反應(yīng)和生產(chǎn)。

圖2. 代表性的ReactIR光譜  a）丙酸叔丁酯原料1及其去質(zhì)子化形成烯醇化物2; b）丙酸叔丁酯1和醛親電子試劑3的組合溶液。

圖3. 反應(yīng)混合物的堆疊NMR光譜

顯示醛3轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物烯醇化物4的程度。使用配備有玻璃流通池的Magritek Spinsolve Ultra 43MHz獲得這些光譜。

圖4. 代表性的UPLC色譜圖顯示了所有測量的反應(yīng)組分

標記為“極性物質(zhì)”的信號主要由4-氟苯甲酸組成，在醛3中作為次要雜質(zhì)存在。并根據(jù)已有數(shù)據(jù)進行進一步分析得到圖5與圖6，對多步反應(yīng)判斷更加準確。

圖 5 用于在線 UPLC 分析的連續(xù)二次采樣和稀釋設(shè)置的示意圖，通過自動進樣。

UPLC 的更高靈敏度意味著與傳統(tǒng) HPLC 方法相比，它還能耐受低得多的分析物濃度。

壓力和泵送穩(wěn)定性

在反應(yīng)器系統(tǒng)運行較長時間后，由于試劑輸送不一致而導(dǎo)致挫折，因此紅外跡線顯示脈沖允許保留高達 50% 的丙酸起始材料。當用壓力曲線交叉檢查 IR 數(shù)據(jù)時，發(fā)現(xiàn)這個時間與泵注射器互換相匹配。泵性能由科里奧利質(zhì)量流量控制器測量，以允許對泵參數(shù)進行微調(diào)。在每個單獨的泵的情況下，發(fā)現(xiàn)理想值是不同的，但是一旦校正就提供無脈動操作。

此外，對操作期間獲取的壓力讀數(shù)的分析顯示出不穩(wěn)定的曲線，在某些情況下，由于部分通道堵塞，觀察到壓力增加了 20bar以上。我們認為堵塞是由鋰鹽沉淀引起的。在大多數(shù)情況下，一段時間后，由此產(chǎn)生的壓力增加會解除堵塞，使系統(tǒng)壓力恢復(fù)到正常水平。然而，部分堵塞不利于長期反應(yīng)穩(wěn)定性，加速泵磨損，而且限制試劑流動和抑制混合。最終，將發(fā)生完全阻塞并需要臨時關(guān)閉該過程。在制造環(huán)境中，這種類型的故障可能需要將大量材料轉(zhuǎn)移到廢物中（尤其是在流程重啟階段），從而導(dǎo)致供應(yīng)鏈復(fù)雜化和資金損失。

對于所有后續(xù)實驗，安裝了具有更寬通道（最小直徑為 0.5 毫米）和更大體積（1.63 毫升）的反應(yīng)器板。在該反應(yīng)器配置中，去質(zhì)子化的停留時間變?yōu)榇蠹s 11 秒，并且在淬滅之前添加親電試劑后還有 99 秒。驟冷的停留時間約為 18 秒。使用這個新的反應(yīng)器板，沒有觀察到進一步的堵塞問題，從而產(chǎn)生穩(wěn)定的壓力分布。

反應(yīng)優(yōu)化實驗

結(jié)合所有三種 PAT 儀器，預(yù)計大量數(shù)據(jù)將能夠在短時間內(nèi)優(yōu)化反應(yīng)參數(shù)。這是作為一次一個因素開始的研究，檢查反應(yīng)溫度（0–40 °C）、醛3負載（1–1.2 當量）和 LDA 負載（1–1.2 當量）的影響.

發(fā)現(xiàn)該過程在 20 °C 下運行最有利。預(yù)計升溫至 40 °C 會提高鋰鹽的溶解度并降低沉淀的可能性，但會對產(chǎn)物5 的形成產(chǎn)生不利影響。當考慮到工業(yè)規(guī)模時，在接近環(huán)境溫度下進行通常需要分批低溫條件的有機金屬反應(yīng)已被證明具有節(jié)省大量能源的潛力。

隨后，使用統(tǒng)計實驗設(shè)計軟件包（Modde v11）將優(yōu)化實驗的響應(yīng)擬合到多項式模型中。通過使用多元線性回歸，根據(jù)醛3和所需產(chǎn)物5的 NMR 和 UPLC 數(shù)據(jù)擬合模型。通過包括所有主要、平方和交互項然后刪除不重要的項來生成模型。R 2值為0.74（3，NMR），0.89（3，UPLC），0.93（5，NMR）和0.84（5，UPLC）的所有模型都實現(xiàn)了良好的擬合。這些模型還顯示出中等至良好的可預(yù)測性水平Q 2值為0.50（3，NMR）、0.79（3，UPLC）、0.66（5，NMR）和0.66（5，UPLC）。已證明醛3當量在探索的當量范圍內(nèi)對所需產(chǎn)物5 的產(chǎn)率沒有影響。增加LDA當量顯示出對產(chǎn)物5產(chǎn)率具有積極影響。觀察到溫度影響的負平方項，描述了從 0 到 20 °C 的產(chǎn)量增加5和從 20 到 40 °C 的下降?；谑褂?UPLC 數(shù)據(jù)。這些模型隨后用于探索實驗設(shè)計空間（圖 6）。

圖 6 使用離線 UPLC 分析的實驗數(shù)據(jù)擬合的模型預(yù)測產(chǎn)品產(chǎn)量的等高線圖。

圖7、橫向擴展運行的反應(yīng)數(shù)據(jù)  a）總體反應(yīng)方案，突出顯示量化的物種; b）圖表顯示了不同儀器檢測到的每個物種隨時間的數(shù)量。

在幾乎整個反應(yīng)期間觀察到酯1的完全去質(zhì)子化，這意味著試劑遞送與任何流速變化的可忽略的影響一致（圖7b，紅線）。當觀察到兩次短暫的干擾時（29和32分鐘），酯1去質(zhì)子化程度降低5％導(dǎo)致產(chǎn)率降低10％，持續(xù)約10分鐘。由這種微小偏差引起的這種顯著影響強調(diào)了該過程對微小變化的敏感性，以及實時反應(yīng)監(jiān)測的能力。

UPLC分析顯示在整個實驗期間所需產(chǎn)物5的產(chǎn)率為70-85％（圖6b，綠線），與來自先前產(chǎn)生的多項式模型的預(yù)測值相對應(yīng)。然而，NMR監(jiān)測提供了85-90％的前驅(qū)物4的始終較高的值。這種差異被認為是由于通過NMR在所需中間體4與副產(chǎn)物6之間的差的差異引起的。

這種副產(chǎn)物來自于將產(chǎn)物烯醇化物4加入到第二個親電試劑分子中（ESI第4.2節(jié)），并且其在整個反應(yīng)過程中的增加與醛3的減少相對應(yīng)。這突出了UPLC作為定量分析技術(shù)的能力，它在眾多化學物種之間的分辨率盡管絕對值存在差異，但兩種技術(shù)觀察到的趨勢基本相同，從而進一步為獲得的數(shù)據(jù)提供了信心。

按比例縮小的連續(xù)流動過程在70分鐘的時間內(nèi)成功運行，通過柱色譜法純化后分離出4.9g所需產(chǎn)物，相當于產(chǎn)率為70％，產(chǎn)率為4.2g h-1。

實驗結(jié)論

本研究已經(jīng)證明了三種不同的在線分析儀器在模塊化反應(yīng)器系統(tǒng)中的集成，可用于多步有機金屬反應(yīng)的優(yōu)化和過程監(jiān)測。該模塊化流動反應(yīng)器可通過多個傳感器和集成控制系統(tǒng)實現(xiàn)實時反應(yīng)監(jiān)測。

使用在線React IR監(jiān)測LDA對丙酸叔丁酯1的去質(zhì)子化，其中可以清楚地量化酯C = O拉伸的消失。隨后，使用醛質(zhì)子和芳基質(zhì)子作為不同的標記，通過在線NMR監(jiān)測烯醇鋰加入到親電子試劑3中的進程。zui終的反應(yīng)性能通過在線UPLC量化，通過定制的連續(xù)二次取樣稀釋系統(tǒng)實現(xiàn)。

利用大量數(shù)據(jù)快速探索反應(yīng)參數(shù)，繪制實驗空間。對于生成的所有多項式模型，獲得了良好的擬合，允許估計每個參數(shù)的小變化將對總體反應(yīng)性能產(chǎn)生的影響。使用集成傳感器和在線分析來監(jiān)控每個反應(yīng)步驟，從而擴大了流程。開發(fā)的具有集成PAT的反應(yīng)器平臺支持數(shù)據(jù)豐富的實驗室環(huán)境，用于實時多步反應(yīng)監(jiān)測; 對于制藥和精細化工行業(yè)實現(xiàn)工業(yè)4.0以及未來實驗室至關(guān)重要。